活菌數怎麼檢測?看看這5大方法


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活菌數怎麼檢測?看看這5大方法

編者按:

活菌數是益生菌產品的重要屬性之一,因為活菌數可能會影響益生菌產品的效果。活菌數不僅對於益生菌企業和消費者俱有重要的意義,對於監管部門而言也十分重要。那麼活菌數要怎麼檢測呢?除了平板培養以外,還有什麼其他方法嗎?

今天,我們共同關注活菌數的檢測,希望本文能夠為相關的產業人士和諸位讀者帶來一些啟發和幫助。

① 活菌檢測

目前,益生菌行業公認的益生菌定義,是2001 年聯合國糧食及農業組織/世界衛生組織聯合工作組提出的:益生菌是指當攝入足夠數量時,會對宿主產生健康益處的活性微生物[1]。因此,根據定義,“活性”是益生菌的一個重要特性。

此外,我國2005 年發布的《益生菌類保健食品申報與審評規定(試行)》中第十二條也明確規定了[2],活菌類益生菌保健食品在其保質期內活菌數目不得少於10[6] CFU / mL(克)。

因此,準確測定益生菌產品中的活菌數量,對生產商和消費者,以及監管部門來說,都意義重大。

目前,我國益生菌行業主要依據《食品安全國家標準-食品微生物學檢驗-乳酸菌檢驗GB4789.35—2016》對活菌數進行檢測。該標准採用了培養法來檢測食品中的活菌數。

不過隨著技術的不斷發展,當前出現了一些檢測活菌數量的新方法,其中一些方法具有一定的應用前景,有機會在未來廣泛應用於益生菌產品的活菌檢測。今天,我們將介紹幾種用於活菌檢測方法,並探討不同方法的優劣之處。

② 基於分離培養:平板計數

平板菌落計數法是指將樣本進行適當的連續稀釋後,取一定量的稀釋樣液塗佈到平板上進行培養,對菌落形成單位(CFU)進行計數,得到現存活菌數量的估計值,並表示為每克或毫升原始樣本的菌落形成單位的方法[3]。

該方法的關鍵在於恰當的原始樣品的稀釋倍數——將培養後的細菌菌落控制在30-300 個為宜。

這種活菌檢測的方法,是當前應用最廣泛、最經典的微生物學檢測技術之一,除了被應用於檢測食品中的活菌數,它還常常被用於水質的檢測[4]。該方法具有成本低、易操作的巨大優勢,但同時也有一定的局限性。

平板菌落計數法存在耗時長,難以應付生長緩慢、活的“不可培養的”微生物的缺點。不僅如此,隨著益生菌相關研究的不斷深入,未來將出現越來越多樣的微生物菌種(菌株),對於這些沒有培養過的菌株,試驗條件都需要摸索與嘗試。

除此之外,該方法測定的結果是總活菌數量,無法準確區分益生菌產品中不同菌株細菌的活菌數目,而當前越來越多的益生菌產品採用多菌株,因此急需其他活菌檢測方法來彌補上述缺陷。

③ 基於基因表達活性:qPCR

轉錄組可以反映出微生物的活力狀態,因此,當前有一些研究人員開始嘗試利用細菌的信使RNA(mRNA),來測定活菌數目。

定量逆轉錄PCR(RT-qPCR)是一種用於檢測基因轉錄情況的常見研究方法。在該方法中,信使RNA(mRNA)首先通過逆轉錄酶轉錄成互補DNA(cDNA)。隨後,以cDNA 為模板進行qPCR 反應。因此,我們可以選取微生物特定基因的mRNA 作為檢測靶標,利用該方法對樣品中的活菌數目進行測定。

為提高基於mRNA 檢測方法的準確性,RT-qPCR 可與疊氮碘化丙錠染色(PMA,可選擇性標記死細胞)和16S rRNA 測序等技術聯用[5],設置死菌陽性對照組,區分出活菌。

目前已有一些文獻採用這種方法來檢測產品中的活菌數量,比如廣泛應用於畜禽養殖中的糞腸球菌[6]。

此種基於基因表達活性的檢測方法,具有靈敏度高、特異性強、快速的優勢;但樣品製備過程中的微小變化,都會影響最終的測定結果,對實驗環境和操作人員的要求較高。同時,還需要根據不同的微生物,制定不同的檢測靶標和對應標準。

圖.流式細胞儀

④ 流式細胞分選技術

隨著技術的發展,流式細胞分選技術已經成為生命科學領域的常見實驗手段之一。在染色或熒光標記的基礎上,可以使用流式細胞分選技術對細菌進行計數。

流式細胞分選技術是一種利用高能量激光照射高速流動狀態下被熒光色素染色的單細胞或微粒,測量其產生的散射光和發射熒光的強度,從而對細胞(或微粒)的物理、生理、生化、免疫、遺傳、分子生物學性狀及功能狀態等進行定性或定量檢測的現代細胞分析技術,它可根據發射光的熒光強度和波長將發光顆粒亞群分開,並可實現單克隆分選,從而對複雜樣本中的細胞進行分類、定量和分離。

流式細胞分選技術具有精確度高,速度快,允許一次檢測大量細菌,可對不同的細菌進行分選,檢測活菌不同的生理活性和細菌大小的優勢[7]。

但由於流式細胞分選技術複雜昂貴,目前主要應用於科學研究,尚未普遍用於益生菌產品的活菌數檢驗,不過國外已有以此作為出廠檢測標準的先例。

圖.拉曼光譜結合人工智能快速鑑定微生物

⑤ 拉曼光譜檢測方法

1928 年,在研究單色光穿過透明液體介質時,印度物理學家CV Raman 首次發現,入射光中很少一部分光子,與介質產生了非彈性碰撞,即入射光照射在介質上時,與介質的分子或原子發生了能量交換,散射出來的光與入射光的振動頻率不同——這就是著名的拉曼光譜效應。

在這一理論基礎上,發展起來的分析技術被稱為拉曼光譜技術,可廣泛應用於液體、氣體和固體的檢測,且可獲得振動頻率為50-4000cm[-1 ]的分子指紋信息[8]。因此,它已被廣泛用於多個領域的化學及生物分子的鑑定與研究中,如食品檢測、生物醫藥、環境衛生和石油化工等。

拉曼光譜技術也可用於活菌計數。有研究人員曾利用活菌與死菌表面電荷的不同,在活菌表面吸附銀離子後進行還原,測試其拉曼增強信號,結果顯示經完全滅活的細菌,幾乎沒有拉曼增強信號,而活菌表面的拉曼增強信號,則非常豐富,以此來辨別活菌[9]。

還有研究人員將分離培養與拉曼光譜技術相結合,以重水製備的營養肉湯培養沙門氏菌,進行氘元素標記,並與共聚焦顯微拉曼光譜聯用,以氘元素特徵拉曼光譜峰,監測區分沙門氏菌為死菌還是活菌[10]。

该技术可从分子水平上,精确反映样品的化学成分组成和分子结构差异,并且表面增强拉曼光谱技术、共聚焦显微拉曼光谱技术的出现,使得其在分析鉴定过程中,更加直观、易于观察和控制,并且结果更加显著,这些优势极大地促进了拉曼光谱技术的发展。

不過由於該技術還在研究之中,所以仍有一些問題需要克服。比如該技術難以區分不同組分拉曼峰的疊加,易出現某些待測物質峰被掩蓋,造成某些組分信息不能完全展現,從而影響最終結果的準確性。

目前,有許多研究人員正在積極克服這些局限性,推動拉曼光譜技術的應用,並認為該方法有望成為替代培養法的新一代活菌數檢測方法。

⑥ 其他方法:細菌的產物

除了拉曼光譜之外,還有一些新型的檢測活菌的方法。益生菌在生長和發酵過程中,可能會分泌一些物質或放出一些氣體,在這些生物標記物的基礎上,也可以通過檢測活菌產生的分泌物或氣體的量,間接確定活菌的數目。

潛在的可用於活菌檢測的分泌物有:III 型分泌蛋白SpaO、蛋白質前體易位酶等[11]。

此外,一些益生菌會產生短鏈脂肪酸等酸性物質,使樣品的pH 值降低,用溴甲酚紫、酚酞、硝基酚等作為pH 指示劑,或利用高精度的pH 計,檢測pH 值的變化量,從而換算出產酸量,並推算出活菌數目[12]。

這類新型的檢測方法想像空間巨大,但目前仍然很不成熟,並且利用生物標記物區分死活菌的標準仍不全面。但是,相信在不久的將來,這些活菌檢測手段會逐漸成熟,為我們檢測活菌數提供更多的可能。

參考文獻:

[1] 糧農組織/世衛組織關於食品中益生菌評估起草的聯合工作組報告。 加拿大安大略省倫敦:糧農組織/世衛組織; 2002年。《食品中益生菌評估指南》。

[2] 益生菌類保健食品申報與審評規定(試行)[J]. 中國食品衛生雜誌, 2005(04):369-370.

[3] 戴維斯益生菌菌株的計數:依賴於培養物的和替代技術的定量活細菌的綜述-ScienceDirect[J]。 微生物學雜誌,2014,103:9-17。

[4] Rygala A,Berlowska J,Kregiel D.用於瓶裝水安全管理的異養菌計數。 流程。 2020年; 8(6):739。 https://doi.org/10.3390/pr8060739

[5] McCarty,SC,Atlas,RM擴增子大小對暴露於氯中的細菌進行PCR檢測的影響。 PCR方法應用。 1993,3,181–185。

[6] 譚剛,周榮,張偉等。 單疊氮化丙錠結合定量PCR和16S rRNA基因測序技術檢測中國烈性白酒窖泥中的活菌和總細菌群落。 前微生物。 2020; 11:896。 2020年5月26日發布。doi:10.3389 / fmicb.2020.00896

[7] Tracy,BP,Gaida,SM,Papoutsakis等。 細菌的流式細胞術:使代謝工程,合成生物學和復雜表型的闡明成為可能。 Curr。 in 生物技術。 2010,21,85–99。

[8] Srivatsan T S.實用拉曼光譜:簡介[J]。 材料與製造工藝,2014。 29(5):649-649。

[9] 周紅,楊D,伊夫列娃·NP,等。 通過表面增強拉曼散射對活菌和死菌進行無標籤原位鑑別[J]。 分析化學,2015。 87(13):6553-6561。

[10] 馮敬敬. 拉曼光譜在食品包裝和生物污染物快速檢測中的應用[D]江南大學,2019。

[11] 高榮,廖X,趙X,劉D,丁T.食品行業中可行但不可培養的病原體的診斷工具:現狀和未來前景。 Compr Rev Food Sci Food Saf。 2021年; 20:2146–2175。https://doi.org/10.1111/1541-4337.12695

[12] https://www.sas.upenn.edu/LabManuals/biol275/Table_of_Contents_files/14-Enumeration.pdf

作者|Jessica

審校|617

編輯|笑咲